二、科研工作与成果
（一）主持或承担科研项目及经费
本专业实验室在研国家各类科研课题35项，其中主持“863”计划项目1项；参加“973”课题1项；主持国家科技攻关/国家支撑计划课题2项；主持公益性行业科研课题1项，参加1项；现代农业产业技术体系专项2项。今年新获批国家自然科学基金9项，省基金1项。
（二）本年度研究工作的主要进展
1、杂交油菜授粉控制系统的研究与利用
1.1 波里马不育细胞质利用及其恢复基因Rfp的克隆
1972年傅廷栋教授等发现的波里马细胞质雄性不育系（pol CMS）在国内外得到广泛应用，被国际上认为“pol CMS是第一个有实用价值的油菜雄性不育类型”(Fan and Stefansson, 1986; Downey, 1989; Robbelen, 1991)。为了解析pol CMS雄性不育的分子机理，我们对恢复基因进行了精细定位，定位区间中的orf进行序列分析发现其中一个为PPR家族成员，把它作为候选基因构建载体，在不育系材料1141A中进行遗传转化。共获得15株育性得到恢复的单株，对其中 7个单株的T1代500个单株进行后续检测，育性恢复的表型均与插入片段共分离。育性的分离情况表明7个株系其中4个株系为单拷贝插入，2个为双拷贝插入，1个为多拷贝插入。充分说明该orf确实是波利马细胞质雄性不育的恢复基因（Rfp）。
RTPCR和qPCR分析的结果表明Rfp油菜的根、茎、叶、花和幼蕾各个组织中广泛表达，幼蕾中表达量最高，说明恢复基因可能主要在花药发育早期起重要功能。对该基因的全长（包括启动子区，CDS和3，UTR）在不育系材料1141A和恢复系材料Bing409中进行比较测序，比较测序结果表明Rfp与rfp 启动子区和3，UTR区分别个有一个SNP，而在CDS上存在45个SNP,导致30个氨基酸发生变化，其中12个氨基酸的极性发生变化。亚细胞定位的结果显示Rfp和rfp均定位于线粒体。这表明该基因表达模式和功能的差异主要是由于CDS区的变异引起的，而且恢复基因与其等位基因功能的差异并非蛋白定位引起的。基于上述的测序结果，开发了针对Rfp的功能标记，可以高效的用于波里马细胞质雄性不育恢复材料的筛选和恢复系的回交选育。
半薄切片结果表明不育单株花药在发育至第5期已经不能形成四个正常的角隅，向后发育也不能形成药室或者形成1-2个异常的药室，而形成的药室中小孢子的发育异常，最终不能形成产生花粉或者产生干瘪的花粉。透射电镜结果表明败育时期出现在花药发育的第3期，不育单株花药中L2层细胞不能正常分化出的药室内壁，中层，绒毡层以及小孢子母细胞。GUS分析结果表明，在花药中，Rfp表达的主要部位在L2层细胞特化出的药室内壁，中层，绒毡层以及小孢子母细胞（小孢子）中，这与不育表型相对应。
为了探究Rfp可能的功能，以pol胞质（不育系）和nap胞质（保持系）线粒体组差异的orf作为探针进行Northern blot的检测，结果发现在遗传转化系和恢复系中orf224转录本发生明显改变，表明Rfp可能参与orf224转录本的加工。对Rfp进行预测发现它具有15个PPR结构域，可能与RNA识别相关，但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的结构域，据此推测可能还存在其他未知蛋白参与该过程。通过酵母双杂，在甘蓝型油菜花蕾cDNA文库中共筛选到了4个可能与Rfp互作的基因，通过BiFC的检测证实这些互作在甘蓝型油菜的线粒体中真实存在。但是，这个复合体参与orf224转录本的加工的具体机制目前正在研究。
相关研究结果已经向Molecular Plant投稿。
1.2 油菜隐性核不育研究与利用
1.2.1油菜隐性核不育S45A恢复基因BnMs1的研究与利用：
对BnMs1的上游和下游的调控网络基因进行了研究，利用启动子截短，找出核心的转录调控区段，再利用酵母单杂技术，获得了上游调控该基因的转录因子。同时利用酵母双杂技术，筛选了高质量文库，获得了一些互作的蛋白。由于BnMs1的启动子为油菜花药特异启动子，对其田间育种应用进行了相关研究，为分子育种打下基础。
1.2.2油菜隐性核不育7365A的遗传模式与利用：
Bnms4a/Bnms4b/Bnms4c 和BnMs3/Bnms3为控制7365ABC的两对基因，其中 Bnms4a/Bnms4b/Bnms4c 为复等位基因，分别位于N07和N19染色体上。BnMs3/Bnms3已经被克隆, BnMs3是与拟南芥叶绿体内膜蛋白ATTIC40高度同源的分子伴侣蛋白，负责核编码蛋白质往叶绿体内部基质的转运。Bnms3相对于BnMs3有不连续的SNP差异，包括核心结构域TPR，结构域截短实验证实了关键结构域的位置。BnMs3是获得性的功能突变，关键结构域上的碱基突变表现出强烈的正选择信号，证实该基因在大约4.7百万年前经历了新功能化的过程。败育的原因不在于Bnms3，而在于Bnms4b基因，BnMs3的新功能可以恢复因其引起的败育。
利用图位克隆中的构建BAC文库的策略克隆了隐性核不育7365A的不育基因Bnms4b基因，该基因为一个年轻的嵌合基因，在已有数据库中找不到其完整序列，由三个原始转录本在大约4.6百万年前形成，相对于其复等位基因Bnms4c为显性不育基因。Bnms4b的复等位位点上的恢复基因Bnms4a已经克隆，育性恢复的分子机理已取得了较好的进展。另外，Bnms4b转化的拟南芥植株表现为彻底的雄性不育，其育性可在特定的热激处理条件下得已恢复，与先前本实验室报道的该油菜不育热激处理育性恢复类似(热激处理使不育系7365A产生花粉进行自交繁殖，再利用自交后代与临保系杂交繁殖，扩大100%不育群体，用于杂交中生产)。并且，该育性系统的另一个恢复基因BnMs3可以稳定恢复该拟南芥的不育表型，这表明利用这些基因可以将该育性系统成功的转移到其他物种中，该优良的育种系统在其他农作物中具有巨大的应用潜力。结合二代测序技术，寻找败育时差异基因表达水平的差异分析，提出不育发生的可能途径，初步建立了Bnms4b引起的败育调控网络。
1.3甘蓝型油菜自交不亲和分子机理研究
根据白菜与甘蓝中自交不亲和S位点基因的信息，我们克隆了自交不亲和系‘S-1300’，恢复系‘10-9-8400’及保持系‘Bing409’中的自交不亲和基因SP11/SCR与SRK。根据S位点基因的序列差异，开发了与各S等位基因共分离的分子标记。遗传分析的结果表明，大部分的甘蓝油菜自交亲和性是显性的，而有少量的甘蓝型油菜的自交亲和性是隐性的。来自A基因组上的S位点对控制自交不亲和性有重要的贡献，但还存在S位点以外其它的调控因子影响着自交不亲和的表型，并且在不同的保持系材料中遗传机制是多种多样的。
在前人的研究基础上，我们发现油菜品系‘Westar’自交亲和的原因是其A基因组上自交不亲和花粉识别基因BnSP11-1的启动子区存在一个Helitron类转座子插入。序列分析结果表明该转座子是在甘蓝型油菜形成后才插入到BnSP11-1基因上的。启动子缺失分析结果表明，Helitron类转座子的插入打破了BnSP11-1基因启动子上决定其时空特异性表达的顺式元件。通过转基因试验互补BnSP11-1基因的功能得到了自交不亲和的油菜‘W-3’。在此基础上我们提出Helitron类转座子的移动在甘蓝型油菜的形成及进化过程中发挥了关键的作用。
以‘Westar’及转基因的不亲和油菜‘W-3’为研究材料，通过转录组测序比较授粉后不同时间点柱头组织中亲和反应与不亲和反应的基因表达变化。我们发现蛋氨酸循环（SAM cycle）路径在柱头组织中很活跃，暗示其可能参与了亲和或不亲和反应，其中蛋氨酸合成酶基因BnMS1 在柱头中的表达量最高。通过RNAi的手段下调BnMS1基因在柱头中的表达部分地打破了‘W-3’的自交不亲和性，证明其为自交不亲和反应的一个正向调控因子。
1.4新型油菜细胞质雄性不育型Hau CMS不育机理研究
芥菜型油菜细胞质雄性不育hau CMS是傅廷栋教授于1999年在华中农业大学发现的新型的油菜细胞质雄性不育类型。通过连续回交，将其倒入到甘蓝型油菜的核背景中。hau CMS芥菜型油菜不育系、甘蓝型油菜不育系败育都非常彻底，不育系没有成熟的花粉粒产生。半薄切片结果表明：hau CMS芥菜型油菜不育系、甘蓝型油菜不育系败育时期都发生在孢原细胞分化时期，属于无花粉囊败育类型。利用透射电镜比较分析hau CMS 不育系和保持系花药的亚细胞结构，结果表明：hau CMS 不育系雄蕊中的线粒体空泡化，发育后细胞发生质壁分离，导致细胞液泡化。通过线粒体基因组比较分析，进一步表明：hau CMS属于异源胞质类型。通过对hau CMS不育系和保持系的线粒体基因组序列对比，找出不育系和保持系特异的开放阅读框，找到与不育相关的ORFs, 利用这些未知功能的ORFs，进一步开发出不育系和保持系特异的SCAR标记，用来区分不育系和保持系；通过构建表达载体，转拟南芥和芥菜型油菜都证明orf288为hau CMS的不育基因，导致不育的核心区段主要在该蛋白的C端，而不在N端的跨膜结构区域，表明育性可能与毒性无关; 通过对芥菜型油菜不育系和保持系花蕾提取RNA进行转录组测序，对差异表达基因进行分析。包括MADS box家族的基因在内的很多参与早期雄蕊发育的基因在hau CMS不育系中都下调表达。参与到氧化还原反应，细胞代谢和蛋白合成等路径的基因在不育系中也有下调表达。2013-2014年通过广泛测恢，从1000多份不同的油菜自交系中筛选hau CMS的恢复材料。总共筛选到3份恢复较好的材料，2014-2015年对这三份材料的育性进一步观察，hw795恢复很稳定。其具体的遗传模式还在进一步研究中。
1.5化学杀雄分分子机理研究
化学杂交剂诱导的雄性败育是杂种优势利用的重要途径。叶片施用低剂量的苯磺隆(tribenuron-methyl, TM)可特异性地诱导甘蓝型油菜雄性败育。本研究以两个油菜品种（品系）及拟南芥为研究材料，通过转基因、遗传、免疫和生理生化等多种方法，揭示了苯磺隆诱导雄性败育的机制。苯磺隆处理油菜后，其花药中苯磺隆的积累量远远大于叶片和茎中的积累，随后在花药中造成了更强的乙酰乳酸合成酶抑制和支链氨基酸饥饿。在油菜和拟南芥中组成型表达或花药特异性表达csr1-1D (CSR1的显性突变)，具有磺酰脲类除草剂抗性)能够消除苯磺隆诱导的花药特异性的乙酰乳酸合成酶抑制和雄性败育的表型，表明乙酰乳酸合成酶是苯磺隆的唯一靶标，乙酰乳酸合成酶失活是苯磺隆诱导雄性败育的主要原因。苯磺隆涂茎实验显示：将苯磺隆涂于侧枝时，只有被涂抹的侧枝是不育的，其他侧枝和主枝都是可育的；将苯磺隆涂于主枝时，只有主枝和涂抹部位以上的侧枝的不育的，其他侧枝都是可育的。这表明苯磺隆被叶片吸收后主要极性向上运输到花药。组成型表达苯磺隆代谢基因Bel的植株能够消除苯磺隆在花药中的积累及苯磺隆诱导的雄性败育。叶肉和维管特异性表达Bel导致花药只有少量苯磺隆积累，并且苯磺隆处理后植株依然可育，表明叶片喷施的苯磺隆主要通过叶肉和维管极性运输到花药。花药显微和蛋白免疫分析表明，苯磺隆处理或花药特异性干涉乙酰乳酸合成酶基因诱导的雄性败育的花药细胞中，自体吞噬活性被极大地提升。与对照相比，苯磺隆处理植株的小孢子和绒毡层被大液泡化伴随着细胞质被大量降解。另外，自体吞噬抑制剂3-MA处理可以部分恢复苯磺隆造成的花粉败育。这些数据表明叶片喷施的苯磺隆被极性运输到花药，通过花药特异性地抑制乙酰乳酸合成酶造成支链氨基酸饥饿，最终诱导自体吞噬型花药细胞死亡。
研究结果发表在Mol. Plant.（2015. 8:1710-1724）。
1.6利用轮回选择创建杂种优势相关群体
在两个轮回选择群体中（恢复系群体R和保持系群体B），随机选出的528份（R258，B270）材料为代表，用分子标记对两群体进行初步分析，结果表明：两个群体内部都具有较好的遗传多样性，两群体在遗传背景上存在较大差异，这与我们建立群体所用材料来源相符，根据遗传距离远的材料能产生较大杂种优势的原理，推断这两个群体在后续育种中有很大潜力。我们与南京农业大学合作共同开发计算机软件，用于分析轮回群体特殊交配设计的试验。共定位到10个性状（主花序角果数、主花序长度、角果长、每角粒数、全株角果数、单株产量、千粒重、总硫甙、含油量、芥酸）86对两位点互作标记。作用方式多样，覆盖面广泛。根据这个结果可以推测：上位性对油菜主要农艺性状的杂种优势表现具有重要作用。
利用油菜60K SNP芯片对从轮回选择恢复系群体改良前后基因组遗传变异进行分析，发现该群体的LD很大，群体内单株不存在明显的亲缘关系。并利用选择性消除分析，共得到672个选择性消除区域（Selective sweep），覆盖了基因组6.95%，约55.6 Mb。其中有53.28Mb（大于96%）分布在C基因组，只有4%左右的选择性消除区域分布在A基因组上。说明我们对C基因组的选择大于A基因组。此外，在改良后群体中共鉴定了431个选择保留SNP（Fixed SNP），基本上均匀分布与油菜19条染色体上。对选择性消除区域内及选择保留SNP周围基因及QTL分析发现，受选择区域内存在大量前人定位到的QTL和已经克隆的基因。这位我们以后的群体改良和分子标记辅助选择提供了理论基础。
1.7油菜产量相关QTL定位研究
产量性状是一个复合性状受微效多基因控制，直接用来进行QTL定位较难。通常将产量性状进行因子分解，对产量构成因子进行QTL定位。一次有效分枝数、株高、单株生物学产量、单株产量、一次有效分枝高度和主花序长度都是构成产量因子。其中，每角粒数、千粒重和单株角果数是构成油菜单株产量的三大因素。近5年，我们实验室用SSR标记、RFLP标记以及SNP标记结合田间性状表型，采用连锁作图和关联作图的方法对产量相关性状进行了QTL定位，定位到了大量的与甘蓝型油菜产量相关性状QTL。该研究结果有利于进一步揭示甘蓝型油菜产量相关性状表型遗传变异，相关标记可以用来进行分子标记辅助选择育种。
相关研究结果发表在 BMC genomics, 2015, 16:379上。
1.8材料创新和新品种选育
继续通过常规育种和分子标记辅助选育相结合的方法，开展油菜生态型细胞质雄性不育系及其恢复系的创建和改良，主要改良的性状包括含油量及其构成、生育期和硫甙含量。目前已经获得一批性状得到明显改善的亲本材料，后期将继续通过DH系培养的方法获得纯合改良系。
本年度推广油菜品种面积达到400多万亩，新选育品种两个：湖北省早熟组审定品种华油杂137和甘肃省审定品种圣光101。