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* 博士论文摘要 *
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甘蓝型油菜隐性核不育分子机理及相关基因功能分析
博士生：周正富 导师：涂金星、傅廷栋教授
甘蓝型油菜隐性核不育（RGMS）材料，由于其具有败育彻底、不育性表现稳定、细胞质来源丰富及恢复源广等优点，已成为利用油菜杂种优势的重要途径之一。目前，在生产运用中主要有双隐性核不材料S45AB和三隐性核不育材料7365ABC。由于7365A可以利用7365C来获得全不育群体，避免了拔除其50%可育株的问题，因而在生产运用上具有更大的运用前景。本研究所选择的材料是近等基因系7365AB，A和B材料的差异仅在BnMs3位点上，该基因的突变影响了7365A的育性。我们利用细胞学结合分子生物学的方法，阐述了7365A隐性核不育的的分子机理，首次提出了BnMs3在油菜花药发育中的功能角色。同时，还利用拟南芥T-DNA突变体的资源，分析了部分差异表达基因的功能。研究的主要结果如下：
1. 甘蓝型油菜7365A隐性核不育分子机理研究
利用半薄切片技术比较了不育材料7365A和可育材料7365B在花药发育细胞学水平上的差异，发现在减数分裂前期两者花药发育没有明显的差异；但进入减数分裂后期，不育材料的绒毡层细胞一直不停地增大和液泡化，且不能向分泌型转化。随后小孢子的释放受阻，导致大部分的小孢子不能从四分体中释放，而少数释放的小孢子也不能形成正常花粉外壁，使得花粉的败育更加彻底。随后的胼胝质壁检测实验发现小孢子不能正常分离的原因是由于四分体周围的胼胝质不能被及时地降解。
利用SSH技术构建了富含在可育材料中上调表达基因的文库，结合反向 Northern blot筛选，获得了76个差异表达的unigenes。我们从中随机选取了7个unigenes来通过Northern blot验证其有效性。同时我们发现根据其不同的表达模式，这7个差异表达的基因可以被分为两类。第一类在不育材料中不表达或在其相应的时期表达较弱；第二类基因在两种材料的花蕾中都表达，但与正常材料中相比，其在花药发育早期不育材料中的表达被延迟或抑制。利用拟南芥基因的功能注释信息，我们初步注释了所获的76个差异表达基因。unigenes结果其中8个不能利用拟南芥的信息注释，另外68个则可以通过拟南芥的基因信息来进行注释。进一步将这68个unigenes的功能进行分类发现，它们可以被分为8大类型。第一类的基因主要编码一些与代谢相关的酶类；第二类包括1个ABC转运蛋白和8个脂转运蛋白，这类基因参与到脂肪酸的转运过程。与拟南芥花药发育的spl/nzz，ems1和ms1突变体芯片数据相比，发现了一些共同下调表达的基因。此外，还发现这些差异表达的基因参与了绒毡层发育、小孢子分离和花粉外壁的形成过程。
由于拟南芥和油菜同属于十字花科，它们的读码框序列和基因功能具有高度的一致性。利用拟南芥花药发育调控网络中的基因信息，结合real-time PCR技术，我们发现，参与绒毡层向分泌型转化过程中的基因TDF1, AMS和MYB103在7365A中的起始表达量受到了明显抑制。此外，5个与绒毡层降解相关的半胱氨酸蛋白酶基因的表达在突变体中也受到相应的影响。小孢子的分离涉及到胼胝质的降解和随后的花粉母初生细胞壁的降解。A6和MSR66都编码β-1,3-葡聚糖苷酶，可能参与到胼胝质的降解过程，它们的表达量在7365A中也受到了抑制；QRT1，QRT2和QRT3参与到了初生花粉母细胞壁的降解过程，real-time PCR检测结果表明QRT1和QRT3在7365A突变体中减数分裂后期的表达量受到抑制。随后，与花粉外壁发育相关的基因NEF1, FLP1, CYP703A2, ACOS5, BnCYP704B1, BnCHS1 (At4g00040), CHS2 (At4g34850) 和MS2, 被用于real-time PCR分析，结果发现这些参与到孢粉素前体物质合成的基因，在7365A中的表达都受到了相应的影响。此外还发现，可能与孢粉素前体物质跨绒毡层质膜运输有关的MSR02（属于ABC转运蛋白家族）基因及可能与其长距离运输有关的脂类转运蛋白（LTPs）的表达在突变体中也都相应地下调。
基于半薄切片、差异基因分离和real-time PCR的结果，我们首次提出了BnMs3在油菜花药发育中的作用模式。
2. 育性相关基因的功能分析
为了进一步获得差异表达基因的功能，我们分析了3个unigenes （BnMSR02, BnMSR42和BnMSR53）对应拟南芥同源基因的T-DNA插入突变体的表型，发现只有MSR02是花粉发育所必需的。MSR02编码一个ABC转运蛋白，该类蛋白与脂类物质的运输有关。绒毡层合成的脂类物质具有两个去向，即向花药表皮（合成花药表皮角质）和向花粉外壁（合成孢粉素前体）。随后的扫描电镜和透射电镜的结果表明, msr02突变体的花粉外壁发育异常，而花药角质层的发育却并没有受到影响。这一结果暗示了MSR02可能仅参与了绒毡层合成的脂类物质向花粉外壁方向的跨膜转运，而没有参与脂类物质向花药表皮的跨膜转运。RT-PCR、启动子分析结合mRNA原位杂交的实验表明，MSR02仅在油菜花药的绒毡层细胞中特异表达。
关键词：甘蓝型油菜；隐性核不育；BnMs3；差异表达；花药发育；ABC转运蛋白
细胞周期基因过表达对油菜生长发育的影响和拟南芥种子发育必需基因ASD的功能分析
博士生：尹团章 导师：周永明教授
甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物之一，在我国食用油生产中占有重要地位。利用现代生物技术进行油菜的改良和改造，创造抗逆、高产和优质新资源，是油菜分子育种的重要内容。细胞周期基因能动地调节着细胞的生长和发育过程。其中AtCYCD3;1，AtCYCD2;1和AtCDKA;1构成的复合体作用于细胞周期中G1期向S期转折的进程。但如何在油菜遗传改良中有效地利用这些基因尚不清楚。本研究目的之一是在甘蓝型油菜中过量表达这三个细胞周期基因，观察转基因后代中细胞周期基因对油菜生长发育的影响，为这些基因的有效利用提供理论基础和技术支持。
通过比较筛选，确立了一种转化效率高的油菜转化程序，即以下胚轴为外植体的暗光培养法，并利用这种方法获得了一批转细胞周期基因的油菜转化系。在以AtCYCD2;1cDNA序列进行转化油菜时观察到转化株中存在转录剪切短接的现象，而来自AtCYCD2;1基因组序列的转化株的转录模式正常。在CYCD2;1转化株中，CYCD2;1基因的表达量和T-DNA插入的拷贝数与表型的强弱存在着一定的联系。在油菜中过量表达CYCD2;1促进了叶片细胞的G1-S转折期的进程，导致植株生育期延迟，植株的营养生长量变小。对转化后代的分析发现，在CYCD2;1转化株中，叶片生长的极性受到影响，导致叶片皱缩、卷曲，同时叶片下表皮细胞变小，细胞外廓未能充分发育。过量表达CYCD3;1和CDKA;1的转化株生长发育的变化不明显。
同时，为了研究双子叶植物种子发育的遗传控制，对一个拟南芥种子发育突变体asd开展了基因定位和功能分析。遗传分析确定该突变体是一个源于T-DNA插入、但由一个点突变所致种子致死突变体。通过图位克隆方法，把突变基因定位到第一染色体上臂的63KB范围之内。利用SALK T-DNA插入突变体分析进行了ASD突变基因的等位性分析，发现该区域内AT1G35680基因的T-DNA插入突变体能产生与asd相似的表型。图位克隆及突变体遗传分析最终确定在asd突变体基因（AT1G35680）的第982位存在一个碱基突变（A→C），导致该基因编码的蛋白质在147位发生了一个氨基酸由苏氨酸 (T)到脯氨酸(P)的改变。等位基因同一性测验和遗传互补测验证明AT1G35680基因点突变导致种子致死表型。进一步分析表型产生的原因发现，突变体的胚胎发育过程中，叶绿体的类囊体的发育受到抑制，从而导致叶绿体的发育异常，最终导致种子胚胎发育停滞在球形期。本研究首次证明ASD是一个叶绿体发生和种子发育必需基因。
甘蓝型油菜硫苷代谢网络的遗传分析
博士生：冯吉 导师：孟金陵
甘蓝型油菜是我国的主要油料作物之一。油菜籽榨油后的饼粕含丰富的蛋白质，是良好的天然动物饲料。然而饼粕中的硫苷是一种有害成分，禽畜食用过多的含硫苷的饲料，会对禽畜产生毒害性。另一方面，硫苷的水解产物在油菜营养体中却可以对油菜起保护作用。因此，低硫苷油菜自身的抗虫抗病性随着籽粒硫苷含量的下降也显著的降低，不利于双低油菜的推广和应用。通过遗传育种的方法，培育出高叶片硫苷但低籽粒硫苷含量的材料，具有重要的现实意义。本研究以甘蓝型油菜TN DH群体（Tapidor为母本，Ningyou7为父本）为研究材料，对叶片、籽粒中各个硫苷分量和总量进行QTL定位和整合分析，将遗传学和基因组学的研究方法应用于代谢组学的研究，构建了甘蓝型油菜硫苷代谢网络和控制硫苷的上位性调控网络，揭示了叶片和籽粒硫苷不同的代谢调控机制。同时选出目标QTL位点，通过前景选择及轮回亲本的背景选择，构建了含有目标片段的的近等基因系。主要结果如下：
1 甘蓝型油菜TN DH群体及两亲本的叶片和籽粒硫苷含量的分析。 测定了四个不同环境条件下TN DH群体及两亲本的叶片和籽粒硫苷总量和分量。两亲本Tapidor和Ningyou7的叶片和籽粒平均硫苷总量均达到了显著性差异，尤其是脂肪族硫苷，在两亲本间的差异更大。而且Tapidor和Ningyou7的籽粒硫苷总量分别是它们叶片硫苷总量的15倍和20倍。在叶片和籽粒两器官中，Ningyou7硫苷总量分别是Tapidor硫苷总量的2.5倍和4倍。TN DH群体的叶片和籽粒中三种类型硫苷和硫苷总量呈现连续的偏态分布，这表明该硫苷性状受多种基因的控制。
2 甘蓝型油菜叶片和籽粒硫苷QTL的检测与分析。 利用MetaNetwork软件对四个不同环境下的叶片和籽粒硫苷性状进行了QTL定位。共检测到324个显著性QTL，其中277个显著性QTL是从籽粒中检测到， 47个显著性QTL是从叶片中检测得到的。由于这些显著性QTL相互重叠，于是利用元分析方法将显著性QTL进行整合。经过两步整合得到64 个代谢物QTL（mQTL）。其中大多数的mQTL（67％）只在籽粒中检测得到，表明这些QTL可能涉及到硫苷从营养器官向籽粒的转运。19％的mQTL同时在叶片和籽粒中检测得到，可能涉及到硫苷在营养器官中的合成途径。还有一小部分的mQTL仅在叶片中检测得到，这些mQTL可能反映了硫苷在叶片中特异的代谢调控。
3 目标QTL的确定和近等基因系的构建。 在64个mQTL中，有2个mQTL, q.mcG-A9b和q.mcG-A9c，控制着4-7个籽粒不同硫苷分量和总量，所解释的籽粒硫苷总量的表型方差均在20%以上，而且只控制籽粒硫苷的积累而不影响叶片硫苷含量，因此这2个mQTL是本研究的目标QTL。利用白菜A9连锁群的BAC和Scaffold序列信息所开发出来的分子标记加密了这2个目标mQTL所对应的遗传图谱置信区间，完成了目标QTL所对应的遗传图谱置信区间与白菜遗传图谱的比对，找到了q.mcG-A9b所对应的的候选基因。以TN DH株系衍生出来的BC2群体材料为基础，以Ningyou7作为回交亲本进行多次回交，得到高世代BC4回交群体材料。利用目标QTL所对应的遗传图谱置信区间内的分子标记，筛选BC4回交群体中含有目标片段为Tapidor带型纯合或杂合的单株。最终在BC4F3材料中筛选到6株含有不同目标片段长度的近等基因系材料。
4 甘蓝型油菜硫苷的代谢网络和上位性调控网络的构建。 基于QTL共定位的信息，利用MetaNetwork分析了12个不同硫苷分量之间的遗传偏相关性，并据此构建了甘蓝型油菜脂肪族和吲哚硫苷的代谢网络。发现了5个新的硫苷代谢调控相关性，它们可能反映了潜在的硫苷合成代谢途径。同时还检测到5碳脂肪族硫苷和3 -吲哚基甲基硫苷从叶片向籽粒运输的途径，推测硫苷运输可能存在特异性。
利用QTLmapper检测了不同硫苷分量和总量的上位性互作对，得到509个达到显著性的上位性互作对。然后将这些互作对连接到所对应的连锁群上，构建了控制叶片和籽粒硫苷的上位性调控网络。通过分析发现叶片和籽粒中硫苷的代谢调控机制存在巨大差异，在一定程度上反映了硫苷在不同组织中的不同代谢调控机制。
5 推测mQTL所对应的基因在代谢途径中的作用。 根据不同硫苷分量之间的遗传相关性及所构建的硫苷代谢网络信息，推测了mQTL和代谢途径之间的联系，并进一步推测了mQTL所对应的基因在相应代谢途径中的作用。结果显示，大部分mQTL联系到硫苷转运和侧链修饰途径，另外39%的mQTL联系到硫苷核心合成代谢，而很少的mQTL联系到硫苷碳链延长和降解途径。说明TN DH群体的两个亲本硫苷的代谢差异主要是由硫苷转运和侧链修饰途径中的基因变异所引起的。
关键词：甘蓝型油菜；硫苷；QTL；元分析；代谢网络；上位性互作；近等基因系
甘蓝型油菜亚基因组间杂种优势分子遗传基础研究
博士生：付东辉 导师：孟金陵
将芸薹属中白菜型油菜(Brassic rapa, 2n=2X=20, ArAr)的基因组片段导入到甘蓝型油菜(Brassic napus, 2n=4X=38，AnAnCnCn)中，形成一类新型的甘蓝型油菜（New type Brassic napus, 4X=38，Ar/nAr/nCnCn）。将新型的甘蓝型油菜与自然甘蓝型油菜（AnAnCnCn)杂交产生的杂交种Ar/nAnCnCn能表现出强大的杂种优势，这种优势我们称为亚基因组间杂种优势。多项研究已证实亚基因组间杂种优势的存在，但其产生的遗传机理仍未得到揭示。为了研究白菜基因组片段的渗透对甘蓝型油菜基因组的结构变异的影响，并揭示亚基因组间杂种优势产生的分子遗传机理，我们利用一个半冬性的甘蓝型油菜品种“华双3号”（简称H3， 2n=38）与一个中国半冬性白菜型油菜品种“天门油菜白”（简称TM，2n=20）杂交，然后再与白菜型油菜回交，通过染色体观察和单粒传的方式衍生了一个由138个F8新型甘蓝型油菜株系组成的重组自交系群体（简称TH-RIL群体）。将TH-RIL每个株系与原始甘蓝型油菜亲本H3回交建立了一个回交群体（简称TH-BC）。将TH-RIL群体、TH-BC群体和两亲本（H3兼作对照）进行了两年一点的田间试验。考察了种子产量、每角果粒数、千粒重、地上部分生物学产量、开花期、株高、分枝数和含油量等8个性状，另外通过上述性状计算获得了单株角果数和产油量两个性状值。
通过表型数据分析结果表明，在TH-RIL群体中，新型甘蓝型油菜千粒重性状与自然甘蓝型油菜亲本相比，变化最为明显。有77.5% TH-RILs株系的千粒重超过H3；近一半的株系在株高、全株角果数和干物质重超过H3；有20.3%的株系在单株产量上超过H3；不足30%的株系在其他性状方面超过H3。这说明白菜基因组渗透到甘蓝型油菜后，能够对甘蓝型油菜产生较广泛的变异。在TH-BC群体中，亚基因组间杂种优势表现突出。中亲优势（Mid-parent heterosis，MPH)变异范围从0.0%（千粒重）到 47.1% （产油量），而超亲优势（over parent heterosis ，OPH) 变异从-7.4%（分支数）到26.9%（产油量）。平均有97%左右的杂交组合的单株产量性状超过H3，群体平均产量中亲优势为28%。这说明，当白菜外源片段渗透到甘蓝型油菜时，表现比较明显的杂种优势。
利用545个SSR标记（289对引物扩增），28个IBAP(intron-based amplified polymorphism)标记，51个着丝粒特有的反转座子标记和248个非着丝粒特有的反转座子标记共872个多态性标记用来进行基因组结构变异分析和遗传图谱构建（命名为TH-RIL map）。构建了一个含有628个标记的新型甘蓝型油菜遗传图谱(TH map)，包括A基因组上的10条连锁群，C基因组的7条连锁群（无C6和C7），其余的8条短连锁群无法与已发表的连锁群相对应。由于TH群体的C基因组供体仅来源于H3，部分C基因组上的连锁群的成功构建是由于部分同源染色体之间发生的同源重组而导致的。TH 图谱总长为2272.8 cM，标记之间平均遗传距离为3.9 cM。
利用该群体进行基因组结构变异分析，新型甘蓝型油菜中一方面被导入了白菜特有的等位基因；另一方面渗透诱发了大量新的基因组结构变异，如等位基因的变异（不同于双亲的新带（N-type）的出现以及双亲共同带的消失（D-type)）。 分析表明新型甘蓝型油菜创建过程中可能有反转座子的激活。为了进一步验证反转座子的激活这一遗传现象，将TH-RIL群体中扩增出的92条新的反转座子片段进行克隆测序，通过与三个转座子数据库进行比对，获得含转座子片段的序列65条，说明这些片段的变异是由于转座子的激活而诱发。同时利用65条序列与芸薹属基因组信息进行比对，设计12个RBIP (retrotransposon-based insersion polymorphism)引物再次证实了其存在。通过基因GO（http://www.geneontology.org/）注释发现在65条新变异的序列中有45条变异序列涉及到功能基因，主要是与代谢，细胞加工和胁迫有关的基因。
利用QTL Cartographer V2.5分析软件对三套数据（RIL群体数据，BC群体数据和MPH数据）进行单位点的QTL扫描分析。9个性状共检测到了123个QTL，其中微效作用但可以重复检测到QTL(简称MR-QTL)有40个，达到显著水平QTL（简称SL-QTL）有83个。利用TH-RIL群体分析白菜基因组的渗透对新型甘蓝型油菜的作用，在TH-RIL群体中检测到58个QTL，有33个QTL定位在包含N-type等位点的区域，这些新检测到的QTL能解释64.2%的表型变异，并且大约40%的QTL对性状表现出正向作用。来源于白菜基因组的Ar等位基因的渗透也对产量和产量相关的性状产生重要影响，另外有6个QTL和1/5的单标记分析位点都来源于B. rapa亲本。
利用TH-BC群体和TH-MPH数据进行杂种优势分析，对在这两个群体中检测的66个QTL进行显性度分析，确定了63个QTL为从部分显性到超显性效应的杂种优势位点。其中包括7个部分显性，6个完全显性和50个超显性。所有的与杂种优势有关的等位基因将可以分成5类，Ar（直接来源于白菜型油菜）, An（直接来源于甘蓝型油菜）, An（间接来自于A基因组发生变异的等位点）, Cn（间接来自于C基因组变异的等位点）和L(分布在未定位的连锁群的一类)。92.0% QTL (58个)分布在A基因组，作用最大的一类来源于新变异的等位点(An)，占总数的47.1% QTL (32)，并且起正向作用的位点比例为56.3%；其次直接来源于白菜等位基因的（Ar）有22.1% QTL (15个)，并且起正向作用的比例为 86.7% (13个)。23.9%的QTL与转座子的激活有关，正负作用的比例大致相等。这说明转座子的激活可以诱导新的等位基因的产生，并且对表型产生一定的影响。
利用QTL mapper 2.0软件进行上位性互作效应检测，从三套数据中共检测到了536个非等位基因互作对。在TH-BC和TH-MPH数据检测的372个互作对中， A-A亚基因组的互作比例最高，为71.4%；其次是A-C 亚基因组的互作为26.5% 和C-C 互作(2.1%)。每个等位基因各来源于五类(Ar, An, An, Cn 和 L )中的一种，可组成15种类型的两位点互作。从互作模型看，比例最大的是Ar-An (20.8%) ，其次为An-An (19.3%) ，平均58.6%互作对产生正向作用。由此可知，从单位点和两位点模型来看，亚基因组间杂种优势首先来源于白菜基因组渗透到甘蓝型油菜中所产生的新的发生变异的等位基因的贡献，其次是直接来源于白菜等位基因的作用，并且正效应的比例略大于负效应。从遗传模式看，亚基因组间杂种优势遗传模式是上位性、显性和超显性效应多种效应的综合作用。
甘蓝型油菜为异源多倍体，A和C基因组的高度相似性（同源基因）为杂种优势固定的研究提供了有利条件。利用TH-RIL群体中检测的203个互作对来分析杂种优势，并存在6对部分同源染色体之间的互作，被认为是固定杂种优势对。TH-RIL群体中的固定杂种优势的研究可为直接提高新型甘蓝型油菜的表型，间接提高杂种优势提供理论基础。
在甘白杂交过程中，由白菜基因组渗透所诱导的等位基因的变异及转座子的激活，诱发新型甘蓝型油菜中大量新等位基因产生。这些新的等位基因所产生单位点效应，它们之间的互作效应，新等位基因与直接渗透的亲本等位基因之间的互作效应成为亚基因组间杂种优势利用的重要理论基础。甘蓝型油菜作为一个多倍体模式物种，其亚基因间杂种优势的机理研究和应用，对为其它物种的相关研究，特别是利用亲本种和近缘种改良栽培种的研究，具有重要的指导和借鉴意义。
关键词：新型甘蓝型油菜；白菜型油菜；等位基因变异；染色体重排；亚基因组间杂种优势；产量QTL
拟南芥小G蛋白RabD2b的表达、定位及生理功能研究
博士生：王芳 导师：吴江生、刘克德
Rab蛋白家族是小G蛋白超家族中最大的一个家族，它们广泛存在于植物、动物及微生物中，调控细胞内不同的囊泡运输过程。Rab1类小G蛋白是Rab蛋白家族的一个亚家族，酵母和哺乳动物的Rab1类蛋白（Ypt1和Rab1）调控从内质网到高尔基体的囊泡运输过程。植物中Rab1类小G蛋白归属于RabD亚家族。拟南芥RabD亚家族又被分为功能不同的两个亚类AtRabD1（包括一个成员AtRabD1）和AtRabD2（包括三个成员AtRabD2a、AtRabD2b 和AtRabD2c）。目前，AtRabD1和AtRabD2a的功能研究开展较多，它们的功能类似于Ypt1和Rab1，调控囊泡运输过程。但另外两个成员AtRabD2b和AtRabD2c的细胞学和生理学功能还不清楚。本研究中，我们分析了AtRabD2b的表达谱和亚细胞定位，同时，利用基因敲除突变体和转基因植株对AtRabD基因的生理功能进行了研究。主要结果如下：
（1） 不同物种（拟南芥，酵母以及哺乳动物）Rab1类小G蛋白的氨基酸序列高度保守，而且它们都具有保守的功能结构域；AtRabD2b能够互补酵母温敏突变体ASY01(ypt1)的缺陷表型，表明AtRabD2b与Ypt1是功能上相似的同源蛋白；
（2） AtRabD2b主要定位在细胞内的点状结构上，其中大部分点状结构与高尔基体膜重合。通过定点诱变的方法获得了AtRabD2b的两种突变形式：组成性结合GTP的活性形式AtRabD2b[Q67L]以及不结合GTP或者GDP的非活性抑制形式AtRabD2b[N121I]。AtRabD2b[Q67L]仍旧定位在与高尔基体相关的点状结构上，而AtRabD2b[N121I]则弥散在细胞质中，表明AtRabD2b的不同核苷酸结合状态会影响它的亚细胞定位；
（3） RT-PCR结果显示AtRabD基因在植株的根、茎、叶、花、角果等组织中都有表达，表明它们是组成性表达的蛋白。GUS组织染色结果显示AtRabD2b在幼苗和成熟期的不同组织中都有表达，但是在幼嫩以及生长发育比较旺盛的部位中优先表达；
（4） atrabd2b单突变体和atrabd2b/atrabd2c双突变体没有出现异于野生型植株的表型。YFP-AtRabD2b [Q67L]的超表达植株出现矮化、莲座叶宽度增加以及花序轴上角果等异常表型。超表达YFP-AtRabD2b[Q67L]还导致了AtRabD2b基因的共抑制，产生了AtRabD2b，AtRabD2c和AtRabD1基因下调表达的转基因植株，这些转基因植株的茎顶端部分由绿变紫，并逐渐坏死，成熟期植株表现出矮化、丛生、不育等表型。这些结果表明AtRabD基因参与了植物的多个生长发育过程，而且AtRabD亚家族蛋白间存在着高度的功能冗余。
（5） 显微切片结果表明，共抑制植株茎段的坏死起始于细胞的死亡，坏死细胞首先在外围的表皮细胞层中发现，然后沿着切面在细胞和细胞之间蔓延。透射电镜观察结果表明在即将死亡的细胞中，叶绿体发育异常，内囊体片层膜数目减少，并且这些细胞中的细胞器被液泡逐渐吞噬。这些结果暗示了AtRabD基因在体内调控的囊泡运输过程对于维持植物某些组织的细胞活性有重要的作用。
AtRabD2b C末端结构域中保守半胱氨酸的缺失或者突变会造成C末端异戊二烯化修饰的改变，并引起AtRabD2b亚细胞定位以及功能的改变。
油菜溶血磷脂酰胆碱基转移酶基因分离及酶活性分析
博士生：郑倩 导师：吴江生、刘克德教授
磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine, PC）不仅是构成生物膜的重要成分，还是脂类合成的重要酰基供体以及植物细胞中脂肪酸修饰作用（如去饱和作用、羟基化）不可替代的底物。PC sn-2位点的酰基不断地发生着去酰基化反应和再酰基化反应，使PC快速地翻转和再修饰，该过程被称为“Land cycle”。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（lysophosphatidylcholine acyltransferase, LPCAT）是“Land cycle”中的一个关键酶，它主要催化溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）酰基化形成PC。通过调控掺入PC sn-2位点的酰基种类，LPCAT能影响PC的脂肪酸组成和特性，也能影响PC和酰基库之间的酰基交换。已有研究指出LPCAT参与的酰基交换在三酰甘油（triacylglycerol, TAG）合成中起重要作用。因此，研究LPCAT在酰基交换中的作用机理，对改造植物中脂肪酸成分，特别是非常规脂肪成分，具有十分重要的意义。本研究中，我们利用异源LPCAT互补功能缺失的酵母突变体，成功分离到拟南芥和油菜中的LPCAT基因，并进一步分析了油菜LPCAT基因的表达谱以及油菜LPCAT的酶活性。主要研究结果如下：
1. 酵母LPCAT缺失突变体lca1∆对LPC的结构类似物——溶血血小板活化因子（lyso-platelet-activating factor, lyso-PAF）表现敏感。根据这一特性，我们用拟南芥幼苗cDNA文库转化酵母lca1∆突变体，通过功能互补，分离到已报道的2个溶血磷脂酰基转移酶（lysophospholipid acyltransferase, LPLAT）基因AtLPLAT1（At1g12640）和AtLPLAT2（At1g63050）。尽管拟南芥中还存在其他已确定的LPLAT基因，我们的结果表明AtLPLAT1和AtLPLAT2是拟南芥中仅有的2个能互补lca1∆突变体的基因，也说明了该互补筛选的方法是严谨和有效的。
2. 为了进一步分离油菜中的LPCAT基因，构建了油菜栽培品种Hero种子不同发育时期的cDNA文库，并用来互补酵母lca1∆突变体。通过互补实验分离到3个油菜LPCAT基因，分别被命名为BnLPCAT1-1，BnLPCAT1-2和BnLPCAT2。阳性克隆测序发现，BnLPCAT1-2在cDNA文库中存在多个具有单碱基差异的cDNA，而BnLPCAT1-1和BnLPCAT2的cDNA中不存在任何单碱基差异。序列比对显示，BnLPCAT1-1和BnLPCAT1-2是AtLPLAT1的直系同源基因，而BnLPCAT2是AtLPLAT2的直系同源基因。
3. 氨基酸序列分析显示，BnLPCAT蛋白属于膜结合O-酰基转移酶（membrane-bound O-acyltransferase，MBOAT）家族，含有溶血磷脂酰基转移酶活性所必需的3个保守MBOAT模体（motifs A-C）。在motif B中，存在一个高度保守的组氨酸残基，被认为是MBOAT家族中一个可能的活性位点残基。进化树分析表明， BnLPCAT的同源蛋白广泛分布在双子叶植物、单子叶植物、裸子植物、苔藓植物和藻类等不同的植物类别中。
4. 分析了BnLPCAT1-1和BnLPCAT2蛋白在不同溶血磷脂和脂酰辅酶A存在时的体外酶活性。用不同溶血磷脂作酰基受体时，BnLPCAT1-1和BnLPCAT2均对LPC有很强的活性，表明它们具有溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶活性。而且两者对16:0-LPC、18:0-LPC和18:1-LPC具有同等活性，说明它们对溶血磷脂sn-1位点的酰基没有明显偏爱性。用不同脂酰辅酶A作酰基供体时，BnLPCAT1-1和BnLPCAT2都偏爱不饱和脂酰辅酶A。两者均对22:1-CoA表现较低活性，说明了超长链不饱和脂酰辅酶A不是两个酶能有效利用的底物。在所有的酶活性分析实验中，BnLPCAT2的活性都明显高于BnLPCAT1-1。
5. 利用定量Real-time RT-PCR分析了BnLPCAT1-1和BnLPCAT2在不同组织中的表达水平。BnLPCAT1-1和BnLPCAT2在所有组织中都表达，而且BnLPCAT1-1的表达水平要明显高于BnLPCAT2。BnLPCAT1-1在生长1周的幼苗中表达量最高，其次是叶片、花蕾和花，而BnLPCAT2的表达量在花蕾中最高。
关键词：甘蓝型油菜；溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶；种子cDNA文库；功能互补；酰基交换；酶活性分析