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* 硕士论文摘要 *
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甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育上位抑制基因（esp）的分子标记开发与评价
硕士生：李婧婧 导师：杨光圣
隐性细胞核雄性不育具有不育性稳定彻底、恢复源广和不存在胞质负效应等优点,成为油菜杂种优势利用的一条重要途径。
目前,国内外利用的油菜隐性核不育系主要有双基因隐性核不育和隐性上位互作核不育两种系统,其中后者是利用最为成功的一种。9012AB属于隐性上位互作细胞核雄性不育系统,其育性受2对隐性重叠不育基因(ms3ms3ms4ms4)和1对隐性上位抑制基因(espesp)互作控制,即两对隐性不育基因纯合时表现雄性不育,但任何一个不育基因为显性或上位抑制基因隐性纯合时育性恢复。根据这种遗传模式,隐性上位互作核不育系统可以实现”三系化”繁殖与制种,即通过“临保系”获得100%不育群体,避免杂交种生产过程中拔去母本行50%可育株的麻烦。然而,由于育性受3对基因控制并且基因之间存在互作,依靠传统的杂交、测交方式及其后代表型鉴定方法,选出性状优良的不育系和临保系将是一项繁琐低效的工作。
开发出与不育基因(ms3和ms4)和上位抑制基因(esp)连锁的分子标记,然后进行分子标记辅助选择(Marker Assisted Slection,MAS)将大大提高育种效率。本研究以甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系9012AB及其临保系T45为基本材料,构建了一个类似F2的分离群体,并开发与esp基因紧密连锁的分子标记。同时,对22种基因型未知的不同油菜材料进行了遗传分析和Esp/esp位点的基因型预测。在此基础上,为了判断标记的有效性和适用性,我们使用32份不同来源的材料,对本研究中开发出的分子标记和实验室后期开发出的43个与Esp/esp位点连锁的标记进行评价,旨在为分子标记辅助育种提供参考。取得的主要结果如下：
1.采用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)与BSA(Bulked Segregation Analysis)结合的方法,筛选了1024对引物组合,获得5个与esp紧密连锁的AFLP标记(L1,L2,L3,L4,L5)。所有的标记都位于Esp/esp位点的一侧,其中L1,L3,L4,L5与esp基因的遗传距离均为0.8cM,L2与esp基因的遗传距离为2.9 cM。
2.与esp距离最近的4个AFLP标记之中的一个标记L1被成功地转化成SCAR标记SCL1,分析含有130个单株的大群体后,其与esp的遗传距离为0.8 cM。
3.对22种基因型未知的不同油菜材料进行遗传分析,最后推测出17种材料Esp/esp位点的基因型,只有一个材料的基因型为EspEsp,其余材料均为espesp4.对44个与Esp/esp位点连锁的标记在32种材料中进行评价,38个标记有多态性,其中12个标记的标记基因型与27种材料的遗传基因型完全相符,5个标记的符合度为96%,其余标记的符合度从11%到78%不等。
利用多重荧光SSR标记构建甘蓝型油菜品种的
DNA指纹图谱
硕士生：张清华 导师：刘克德
油菜品种DNA指纹数据库的构建在油菜品种纯度及真实性鉴定、品种权登记保护、区试及审定品种质量监控等方面具有重要应用价值,对理清我国油菜种质的亲缘关系、杂种优势群划分、种质创新及新品种选育具有重要指导意义。
本课题基于毛细管凝胶电泳和荧光SSR标记,建立了一套高通量油菜品种SSR检测体系,为大规模油菜品种鉴定和大规模油菜DNA指纹图谱的构建奠定了基础。本论文以SSR标记为技术手段,对多重PCR体系建立的基本过程及荧光标记多重PCR组合的确定等油菜DNA指纹库构建的关键技术环节进行了研究。本论文形成如下研究结果：
(1)根据本实验室已构建的甘蓝型油菜高密度遗传连锁图谱以及之前的引物筛选结果,初步挑选出52对多态性高、扩增质量好的SSR引物。将左右引物5’端分别加上M13F和M13R接头,通过聚丙烯凝胶电泳检测发现其中24对引物扩增效果较好,可入选多重PCR组合。同时记录各产物间的相对大小关系。
(2)对入选的引物进行多重PCR组合,探讨了多重PCR构建的基本过程。采用6-FAM和HEX荧光染料标记上游通用引物M13F,通过调整PCR体系中各反应成分的量和反应条件,最终确定了一套完整的多重PCR扩增和检测体系。在ABI3500 Genetic Analyzer上对扩增产物进行电泳分析,GeneMapper 4.1软件分析产物片段大小并进行分型。
(3)本实验以筛选到的16对SSR引物对179份油菜进行基因分型。16对SSR引物分别检测到2-9个等位变异,共检测到78个等位变异,平均每对引物检测到4.88个等位变异,各引物的PIC值分别为0.35-0.97,平均为0.82。聚类分析显示该供试品种的遗传多样性相对狭窄。(4)根据多重PCR组合的结果,结合PIC值和鉴别力,确定核心引物组合,构建179份甘蓝型油菜品种的指纹图谱。最后用9对SSR引物构建了179个甘蓝型油菜品种的指纹图谱。利用核心引物组合扩增的方法,可以鉴定油菜杂交组合及其亲本的真实性和纯度。
甘蓝型油菜黄化突变体的基因定位
硕士生：陈艳丽 导师：傅廷栋
叶片是植物进行光合作用的主要器官,在植物生长发育过程中起着重要的作用。叶色发生突变会影响植株的光合作用和生长发育。
叶色突变体不仅是研究高等植物光合作用不可或缺的重要材料,同时也对研究叶绿素的生物合成,叶绿体结构发育和遗传转化,了解核质互作等发面具有重要的作用。叶色突变体还可作为标记性状应用于杂交种子的纯度鉴定。
甘蓝型油菜黄化突变体bnaC.ygl是在甘蓝型油菜品系T6的EMS诱变后代中发现的,该突变体黄化性状受1对隐性核基因控制。bnaC.ygl基因被定位于甘蓝型油菜的N17连锁群。本研究以甘蓝型油菜黄化突变体系bnaC.ygl及其野生型T6为材料,研究其叶绿素含量和叶绿体的形态和发育。并对突变体bnaC.ygl进行了基因定位。主要取得的研究结果如下：
1.苗期测量bnaC.ygl和T6的叶绿素含量,结果表明bnaC.ygl的叶绿素含量较T6的表现下降,叶绿素a和叶绿素b分别下降40.3%和57.7%,说明bnaC.ygl黄化性状是总叶绿素含量的大幅度下降引起的。而叶绿素a/b却显著高于T6(P<0.05),表明叶绿素b的下降幅度大于叶绿素a。
2.运用透射电子显微镜观察突变体和T6的叶绿体形态和发育,结果显示,虽然bnaC.ygl叶绿体的形状和T6一样呈纺锤状,但是bnaC.ygl叶绿体的基粒垛叠少,内囊体膜明显减少。表明该突变体中叶绿体的发育受到一定程度的影响。
3.选取bnaC.ygl与丙409的F2、BC3和BC4作为定位群体。利用绿叶基因池和黄叶基因池筛选EM、PM和TE组合的AFLP引物,用在基因池中表现出多态性的引物扩增绿苗和黄化苗基因池中的单株。再用表现出多态性的引物扩增BC4群体中的2400单株。共得到28个与bnaC.ygl基因连锁的标记,其中的20个标记与目标基因距离较近,均为0.42cM。
甘蓝型油菜花叶性状的遗传及基因定位
硕士生：晏仲元 导师：吴江生
花叶是油菜的一种叶片形态,可应用于杂种鉴别、纯度鉴定以及遗传学研究等。前人关于油菜花叶的遗传学研究表明：花叶受一至两对质量基因控制,遗传关系相对简单,但至今未见对该性状进行基因定位的研究报道。本研究以4个甘蓝型油菜品种(系)配制的组合Ⅰ(No.2127-17/花叶恢)和组合Ⅱ(YZ001-6/G350)的P1、P2及其F1和F2共四个世代为材料,结合采用SSR与BSA方法,筛选与花叶主效基因紧密连锁的SSR标记,用于分析作图群体基因型并绘制遗传连锁图,实现花叶主效基因的初步定位。另外,比较了两个遗传图谱间SSR标记的共线性并对定位区域进行了生物信息分析。主要结果如下：
1.F1植株叶形表现为半花叶说明花叶是不完全显性性状。
2.遗传分析结果表明花叶性状受一对主效基因控制,将该基因命名为BnML (Mosaic-leaf in Brassica napus)。
3.组合Ⅰ花叶主效基因定位于分子标记BrGMS3707与SSR648之间,遗传图距分别为16.2cM和8.3cM；组合Ⅱ花叶主效基因定位于分子标记BrGMS4768和BrGMS4779之间,遗传图距分别为4cM和6cM。
4.利用BrGMS3705与SSR648在两个组合遗传图谱间的共线性,将花叶主效基因BnML定位于甘蓝型油菜A10染色体,即分子标记BrGMS4768和BrGMS4779之间10cM遗传图距范围内,为BnML基因的精细定位及克隆奠定了基础。
5.通过标记序列与白菜基因组序列的比较分析,进一步将定位区域缩小至白菜拼接序列上975kb的物理距离范围内。通过高度保守的蛋白质结构域搜索,在此区域预测到4条与拟南芥的叶形调控家族基因高度相关的候选序列,为后续研究提供了有益启示。
油菜抗草甘膦除草剂资源的鉴定及筛选
硕士生：柳寒 导师：周永明
油菜(rapeseed)是世界广泛种植的油料作物之一,是重要的食用油源和蛋白质饲料来源,也是重要的工业原料。我国油菜种植面积和总产量均居世界首位,然而每年的生物和非生物胁迫都对油菜的高产稳产造成严重威胁,提高油菜抗胁迫能力将能显著提高产量。草害是油菜最重要的生物胁迫之一,也是油菜高产的主要障碍之一,不仅造成油菜大幅减产,还花费了大量的劳动力除草。因此,对杂草的有效防治与根除对油菜生产具有重大意义。
影响油菜生产的杂草种类繁多,化学除草对施药时间和剂量都有严格要求,对作物有一定的适用范围,对杂草有一定的选择性,往往难以达到理想的效果。因此,培育和推广抗除草剂油菜品种可以有效控制草害,减少中耕除草用工,提高油菜产量,增加效益。
本研究一方面将人工合成改造的抗草甘膦基因cp4-epsp转化拟南芥和油菜进行抗性鉴定,另一方面对油菜种子进行甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate, EMS)诱变,在M2代中筛选抗草甘膦突变体,同时还克隆了白菜型油菜中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSP合成酶)基因,其主要研究结果如下：
(1)获得了cp4-epsp转基因拟南芥和油菜植株,抗性鉴定结果表明转基因植株在稀释100倍的41%农达异丙胺盐制剂喷洒条件下仍能继续生长,而对照即使使用稀释400倍的同等制剂喷洒也不能存活。
(2)以湘油15号种子为材料,使用0.45%的EMS诱变剂处理后获得了诱变群体M1代。用稀释200倍的41%农达异丙胺盐制剂喷施M2代4-5片真叶期植株筛选抗草甘膦突变体,结果植株10天后全部枯萎凋亡,没有筛选到抗性株。
(3)在白菜型油菜Yellow Sarson中克隆到epsp基因的两个拷贝epsp384和epsp319。序列分析表明这两个拷贝的核酸序列同源性为92%,蛋白质序列同源性为95%。进化树分析显示epsp384与中国白菜中的epsp基因来源相同,epsp319与甘蓝型油菜中的epsp基因来源相同。与21个不同来源的EPSP合成酶蛋白质序列进行比对分析发现,其大部分氨基酸均高度保守。
芥菜型油菜多室性状的遗传分析及其基因的分子标记
硕士生：吕泽文 导师：沈金雄
油菜是我国重要的油料作物之一,每年大约有40-42%的食用植物油来源于油菜。培育优质高产的油菜品种是当前育种工作者的首要目标。多室角果油菜相比于两室角果油菜,其每果粒数显著增多,在油菜适宜密植、直播及机械化操作等生产与遗传改良中,多室性状无疑具有重要作用。目前已报道的多室油菜类型有白菜型油菜和芥菜型油菜。
研究结果表明,白菜型多室性状受一对隐性核基因控制,芥菜型油菜多室性状虽也为一对隐性核基因控制,但还为微效基因所修饰。白菜型油菜的多室性状位于A基因组上,遗传不够稳定,多室单株常表现为多室角果和两室角果嵌合存在现象；芥菜型油菜的多室性状基因位于B基因组上,其角果多室性状遗传比较稳定。
本研究所用的材料为芥菜型油菜,包含1个多室材料和3个两室材料,通过多室性状的遗传模式鉴别、多室和两室子房进行石蜡切片比较以及分离群体的AFLP、SCAR和SSR等标记技术分析,对芥菜型油菜多室性状遗传规律、产量性状特点以及多室性状基因定位等进行了初步研究,取得以下主要结果：
1.多室材料与两室品种正反交F1单株全部为两室角果,F2两室单株和多室单株的分离比为15：1,F1单株与多室亲本回交获得的BC1群体中两室与多室的分离比为3：1,说明多室性状受2对独立遗传的隐性核基因控制,且角果性状不因正反交方式不同而存在差别,证实多室性状无细胞质效应。这说明本研究供试用多室材料与已有文献报道的完全不同。
2.多室材料和两室材料角果和子房石蜡切片的观察发现,多室材料的角果由4心皮发育而来,4个果瓣包围种子,两个假隔膜平行(白菜型油菜多室角果假隔膜交叉呈十字形),将角果分隔成3个腔室(而不是4腔室),中间的腔室比较大,两侧的腔室稍小,且本研究用多室材料假隔膜发育无白菜型多室油菜发育障碍或中途退化而形成多室与两室角果嵌合现象。
3.对BC1分离群体中的多室单株和两室单株的主要产量性状进行了考察,发现多室单株的千粒重和单株有效角果数均小／少于两室单株,但每果粒数和单株产量显著高于芥菜型两室单株,说明多室单株中对单株产量增加贡献最大的是每果粒数。
4.利用AFLP技术结合BSA法对BC1和BC2群体进行标记筛选,在BC1群体和BC2中均筛选出9个AFLP标记,这些标记分布在目标基因的两侧,距目标基因6.3～26.5cM。将BC2群体中筛选到的AFLP差异片段测序,与白菜BAC序列进行比对,根据白菜BAC序列设计SCAR引物和SSR引物,获得了一个SSR标记SSR18和一个SCAR标记SCAR07,分别距目标基因11.5cM和14.9cM。将获得的AFLP、SCAR和SSR标记在扫描BC1F2群体,构建了两室性状基因Mc1的遗传连锁图,并根据白菜BAC信息,初步确定了Mc1基因所在的连锁群。
5.利用获得的与Mc1基因连锁的分子标记对分别含有Mc1和Mc2基因的BC2群体进行了鉴别,确定了这些群体的基因型,为进一步构建大的分离群体以精细定位、克隆Mc1和Mc2基因奠定了基础。
甘蓝型油菜双向导入系的构建及评估
硕士生：曾丽萍 导师：孟金陵
本实验室以欧洲甘蓝型油菜冬性品种Tapidor和中国半冬性栽培种宁油7号为亲本,构建TN DH群体,包含202个株系；并以该群体为母本,Ningyou7为父本,经过4次回交构建了导入系群体,称之为T-BC4群体。
本研究目的为构建甘蓝型油菜双向导入系,因此以Tapidor为父本,构建了世代平衡的回交导入系群体,称之为N-BC4群体。同时,对双导入系群体进行了初步评估,并利用N-BC4群体对A9硫甙性状相关QTL进行了分析和研究。
主要结果如下：完成甘蓝型油菜双向导入系的构建。以Tapidor为父本,构建N-BC4导入系群体。经过回交和自交的方法,得到包含大于4000个单株的BC4F1和BC4F2群体,完成了与T-BC4群体世代平衡的甘蓝型油菜双向导入系构建。另外分别得到来源于111个DH系对应239个单株BC2F1,360个单株BC2F2自交种；107个DH系对应501个单株BC3F,,105个DH系对应418个单株BC3F2自交种。以Ningyou7为父本的T-BC4群体,通过自交,得到来源于131个DH系对应BC4F2单株。经过回交,得到85个株系、133个单株的BC5F1回交种。对双向导入系进行了初步评估。结合开花时间,利用A10和C6 QTL区间内特异性分子标记对T-BC4群体和N-BC2群体进行了评估。调查两个群体约2000个单株开花时间,表明花期持续时间为30天,但即使来源于同一DH系的单株开花时间也有较大差异。
同时,通过14对C6和3对A10连锁群开花QTL区间内分子标记进行评估,结果表明在双向导入系中同一QTL的作用刚好相反。开花时间早晚是由于导入相应染色体片段引起的,初步证明导入系群体构建成功。加密A9连锁群硫甙性状相关目标QTL所对应的遗传图谱置信区间。同时,利用T-BC4群体,通过A9连锁群硫甙QTL区间内分子标记进行筛选,为构建分离群体做准备。基于早期研究对对叶片、籽粒中各个硫苷分量和总量进行QTL定位分析,共有2个mQTL,表型方差均在20%以上。
本研究利用白菜A9连锁群的BAC和Scaffold序列信息开发分子标记,加密QTL所对应的遗传图谱置信区间,完成目标QTL所对应的遗传图谱置信区间与白菜遗传图谱的比对。通过BAC和BAC-end共设计57对引物,其中3对定位到A9连锁群QTL区间内。经过QTL重新整合分析,目标QTL区间缩短为2cM。对来源于7个DH系810个BC4F2单株以及来源于11个DH系2000个BC4F3单株套袋自交,得到自交种,测定硫甙含量。同时利用目标QTL所对应遗传图谱置信区间内分子标记,对基因型进行筛选,结合基因型和表型,为构建分离群体奠定基础。