二、科研工作与成果

（一）承担科研课题情况

本专业实验室2016年度获批各类科研课项目29项，，到账经费1918万元。其中国家自然科学基金12项，国家重点研发计划主持1项，参加3项。

（二）研究工作的主要进展

1、油菜杂种优势利用及相关基础研究

1.1 波里马不育细胞质利用及其恢复基因Rfp的克隆

波里马细胞质雄性不育（pol CMS）是傅廷栋教授在1972发现的一个甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料，被认为是第一个有实用价值的油菜雄性不育类型，在甘蓝型油菜、白菜等芸薹属作物的杂种优势利用中起着重要的作用。为了解析pol CMS不育与恢复的分子机理，我们对不育与恢复系的幼小花蕾进行了转录组测序，并对其恢复基因进行了精细定位和克隆，随后对恢复和不育基因的互作模式进行了研究。

我们的转录组研究认为不育基因的完整转录将导致ATP6蛋白的高级结构出现异常而导致不育材料的花蕾中出现能量缺陷，而能量的缺陷将使核质间物质和信号传输受到影响进而导致控制花药发育的关键基因NZZ/SPL及其下游的一些基因表达受到抑制，最终使花药败育。我们对恢复基因的克隆研究发现pol CMS恢复基因是PPR家族一员，将该基因在不育系材料1141A中进行遗传转化，共获得15个育性得到恢复的单株。对其中7个单株的T1代500个单株进行后续检测，充分说明该orf确实是波里马细胞质雄性不育的恢复基因（Rfp）。

qRT-PCR分析表明pol CMS不育基因orf224在不育花蕾中的表达量是可育花蕾的四倍；而其恢复基因Rfp在油菜的根、茎、叶、花和幼蕾各个组织中广泛表达，幼蕾中表达量最高，说明恢复基因可能主要在花药发育早期起重要功能。我们对Rfp和rfp进行了比较测序，结果表明其启动子区和3，UTR区分别个有一个SNP，而在CDS上存在45个SNP,导致30个氨基酸发生变化，其中12个氨基酸的极性发生变化。亚细胞定位的结果显示Rfp和rfp均定位于线粒体。基于上述的测序结果，开发了针对Rfp的功能标记，可以高效的用于波里马细胞质雄性不育恢复材料的筛选和恢复系的回交选育。

我们以线粒体差异orf作为探针进行的Northern blot检测结果表明在遗传转化系和恢复系中orf224转录本发生明显改变，表明Rfp可能参与orf224转录本的加工。对Rfp进行预测发现它具有15个PPR结构域，可能与RNA识别相关，但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的结构域，据此推测可能还存在其他未知蛋白参与该过程。为了研究恢复基因与不育基因之间的相互作用模式，我们利用酵母双杂技术找到了6个可能与Rfp互作的候选基因。随后，我们通过BiFC在甘蓝型油菜原生质体中验证了这些候选基因，其中有4个与恢复基因存在互作。对这四个候选基因，我们首先构建了其干涉载体并完成了对甘蓝型油菜的遗传转化；我们也构建了融合FLAG标签的恢复基因载体，完成甘蓝型油菜不育系的遗传转化。相关研究结果发表在2016年Molecular Plant上。

1.2 油菜隐性核不育7365A的遗传模式与利用

Bnms4a/Bnms4b/Bnms4c 和BnMs3/Bnms3为控制7365ABC的两个基因位点，其中 Bnms4a/Bnms4b/Bnms4c 为复等位基因，位于N07染色体上。BnMs3/Bnms3位于N19染色体上，在2011年已经被克隆, BnMs3是与拟南芥叶绿体内膜蛋白ATTIC40高度同源的分子伴侣蛋白，负责核编码蛋白质往叶绿体内部基质的转运。Bnms3相对于BnMs3有不连续的SNP差异，包括核心结构域TPR，结构域截短实验证实了关键结构域的位置。BnMs3是获得性的功能突变，关键结构域上的碱基突变表现出强烈的正选择信号，证实该基因在大约4.7百万年前经历了新功能化的过程。败育的原因不在于Bnms3，而在于Bnms4b基因，BnMs3的新功能可以恢复因其引起的败育。

利用经典图位克隆技术，结合BAC文库的筛选，确定了Bnams4b的候选基因并进行转基因互补验证，序列比对分析发现Bnams4b为一个新起源的嵌合基因，在已有数据库中找不到其完整序列，能引起野生型拟南芥和油菜的雄性不育，调查了该基因的起源，演化和选择历史，发现该基因在基本种黑芥（基因组BB）分化之后，基本种甘蓝（基因组CC）分化之前通过至少2次的外显子重组而产生。该基因只在油菜，甘蓝，白菜和芥菜型油菜的部分品系中存在。在其起源之后，由两个基因弥补了其带来的负效应（不育和潜在的植株黄化）：BnaMs3和Bnams4a。研究发现BnaMs3与Bnams4b是协同演化的关系，BnaMs3经历了新功能化的过程，能特异的弥补Bnams4b所产生的败育和黄化负效应，从而使得早期含有Bnams4b的植株得以存活并正常繁殖后代；Bnams4a则是利用表观修饰的路径来抑制Bnams4b的嵌合转录本的表达来抑制Bnams4b所产生的负效应。本研究克隆的Bnams4b位点是植物中具有育种应用价值的嵌合新基因的首次报道，开发的系列分子标记以及获得的Bnams4b所在区段为油菜育种的提供了重要参考，以该基因为核心的雄性核不育系统的育种应用也会更加全面和完善。另外，Bnms4b转化的拟南芥植株表现为彻底的雄性不育，其育性可在特定的热激处理条件下得已恢复，与先前本实验室报道的该油菜不育热激处理育性恢复类似(热激处理使不育系7365A产生花粉进行自交繁殖，再利用自交后代与临保系杂交繁殖，扩大100%不育群体，用于杂交中生产)。并且，该育性系统的另一个恢复基因BnMs3可以稳定恢复该拟南芥的不育表型，这表明利用这些基因可以将该育性系统成功的转移到其他物种中，该优良的育种系统在其他农作物中具有巨大的应用潜力。结合二代测序技术，寻找败育时差异基因表达水平的差异分析，提出不育发生的可能途径，初步建立了Bnms4b引起的败育调控网络。基因获得专利授权，相关研究结果发表在2016年Plant Cell上。

1.3 甘蓝型油菜自交不亲和分子机理研究

喷施盐水是打破甘蓝型油菜自交不亲和的方式之一，与剥蕾自交、CO2等方法相比，具有操作容易、省时省力等优点。然而，利用盐水打破自交不亲和的分子机理尚不明确。利用蛋白质组学分析盐水处理后特异表达的蛋白质，有助于揭示盐水对自交不亲和性的影响机制。蛋白质组学测序结果表明，盐水处理后蛋白质的表达特征与亲和反应相似。目前，已在差异表达蛋白中，筛选可能与盐水处理相关的编码基因进行功能分析。

以‘Westar’及转基因的不亲和油菜‘W-3’ 为研究材料，通过磷酸组学测序预测自交不亲和反应中雌性决定因子受体激酶SRK作用的底物或下游基因。共有2526个磷蛋白被鉴定出来，并且发现逆境胁迫、免疫应答、miRNA及表观遗传学调控、细胞壁修饰等信号传导途径在亲和及不亲和反应中存在差异。结合磷酸组学测序结果，我们利用酵母双杂交技术，以SRK为诱饵蛋白，筛选可与SRK互作的底物或下游信号因子，目前已筛选到一个转录因子，将进行进一步验证。