4、优异种质资源筛选与新基因发掘

4.1芸薹属不同基因组染色体的稳定性差异及其利用

4.1.1从甘蓝型油菜中分离原始白菜及以其为背景的全套C亚组染色体单体附加系（MAALs）的创建

异源四倍体甘蓝型油菜（Brassica napus L., AACC）是异源多倍体多倍化进程研究的模式植物。我们通过远缘杂交诱导甘蓝型油菜中C亚基因组染色体的优先消除，抽离出了整个A亚基因组，进而重建了祖先种白菜型油菜（restituted B. rapa L., RBR）。与天然白菜相比，RBR ZS11表现出一些特有的形态特征，例如生活力弱、易感病、叶片有毛，花型较小且花瓣皱缩，自交结实不正常，特别是冬天叶片贴地生长等。同时，以本实验室先前获得的一个RBR Oro做父本，与亲本甘蓝型油菜“Oro”进行杂交及连续回交，将C亚基因组的单条染色体附加到剥离的A亚基因组上，在同一背景下对C亚基因组进行解析。最终，通过C基因组染色体特异基因引物的PCR扩增及FISH方法鉴定出了全套的单体异附加系（MAALs）。相比于亲本RBR Oro，MAALs表现了一些可能由附加C染色体决定的特异性状，例如AAC2的叶片蜡质。MAALs终变期的染色体配对以及雌、雄配子的传递率均有较大的差异，可能与附加的C基因组染色体与A基因组的同源性及甘蓝型油菜中调节染色体配对的机制有关。其中，AAC1、AAC2表现较高的异源配对三价体，且二者的雌、雄配子传递率显著高于其它MAALs，而AAC9的异源配对三价体频率及雌、雄配子传递率均最低，这可能与C9染色体携带有调控甘蓝型油菜染色体配对的一个主效位点（PrBn）相关。最后，借助于全套MAALs，通过设计特异的基因引物进行PCR扩增，将C亚基因组的22个较大的未定的Scaffolds锚定到了对应的C基因组染色体上，证实该套附加系在优化基因组信息上的特有作用。RBR及MAALs的获得为甘蓝型油菜的基因组进化及基因组互作研究提供了新的思路及材料。

4.1.2人工合成芸薹属异源六倍体的细胞遗传学研究

对四种不同来源的六倍体（埃塞俄比亚芥×白菜，芥菜型油菜×甘蓝，（白菜×甘蓝）×黑芥），（甘蓝×白菜）×黑芥）不同世代群体单株的核型、染色体组成、减数分裂和育性进行了分析，以了解不同来源合成六倍体的稳定性差异。双色原位杂交分析发现人工合成芸薹属六倍体连续自交过程中，染色体数目逐渐减少，三个不同基因组具有B>A>C的稳定性差异。六倍体自交后代染色体数目逐渐趋于36条，为具有AABB染色体组的新型芥菜型油菜，而C基因组染色体全部丢失。对六倍体减数分裂中染色体行为的分析表明，A、C基因组染色体间的部分同源配对是造成C基因组染色体极易丢失的原因。在这些人工合成的芸薹属异源六倍体中，染色体变异的范围大于人工合成的异源四倍体甘蓝型油菜和人工合成的异源六倍体小麦。上述结果表明，二体遗传和非二体遗传减数分裂染色体行为导致了这些连续的代际间的整倍体和非整倍体遗传。在人工合成的芸薹属异源六倍体中的减数分裂驱动的不同基因组的稳定性差异，可能和芸薹属B/A/C 三个基因组内在固有的基因组性质及相互关系有关。本研究的结果提供了在异源多倍体化的早期阶段，不同基因组细胞遗传学形为差异的新的理解。

4.2人工合成油菜多倍体基因表达研究

4.2.1不同来源人工合成甘蓝型油菜杂种的基因表达研究

分别用从“奥罗”分离的白菜型油菜和天然白菜与同一甘蓝杂交，人工合成两个甘蓝型油菜杂种（AC, n=19）。通过对这两个杂种及天然甘蓝型油菜“奥罗”进行转录组比较分析，以研究经过异源多倍化的A 基因组及自然进化的A 基因组对基因表达的影响。两个杂种中大部分基因表现为加性表达，超亲表达相对较少，但在天然四倍体中非加性表达和超亲表达基因数目却显著增多。在合成杂种和天然四倍体中有很大一部分基因表现为表达水平显性（Expression level dominance；ELD）。A-ELD 和C-ELD 除了基因数目上相近，没有基因组偏向性外，两者在功能上也非常相似。通过比较部分同源基因在亲本和后代中的表达情况，发现亲本中的表达模式大部分遗传到合成杂种/天然四倍体，尤其是当基因对表达不存在差异时。和表达水平显性一样，部分同源偏向表达(Homoeolog expressions bias)也存在基因组间平衡。总之，表达水平显性和部分同源偏向表达在最初杂交时就不存在基因组偏向性表达，且这种基因组表达平衡状态在长期驯化过程中得以保持。虽然两个杂种间基因表达模式高度保守，但分离白菜的合成杂种中非加性表达、表达水平显性、部分同源偏向表达的基因/基因对数目都比天然白菜的合成杂种中要少，表明经过异源多倍化的A 基因组比天然的可能对杂交有更好的适应性。

4.2.2甘蓝与白菜不同倍性杂种中基因表达的剂量效应

利用白菜与甘蓝杂交（包括正反交），获得了不同倍性的杂种及加倍植株（AC，AAC，CCA，CCAA）。利用转录组测序技术对苗期叶片的基因表达进行了分析。根据不同个体中包含的A与C亚组个数的不同，以及基因表达量的变化特点，将基因分为基因组剂量依赖型与剂量非依赖型。结果表明，A与C亚组基因的表达变化与基因组剂量的关系是一致的。剂量依赖型基因的表达水平与基因组剂量的改变显著关联，为剂量效应的主要来源；而剂量不依赖型基因的表达水平与基因组剂量关联不显著，为剂量补偿效应的主要来源。根据剂量平衡理论，我们也在剂量不依赖型基因中发现了更多的参与蛋白-蛋白互作的基因。剂量依赖性基因表达变化可能主要来自反式调控，而剂量不依赖型主要源于顺式效应。 基因功能聚类分析表明，剂量依赖型基因主要参与基础生物学过程如生长于发育进程等，而剂量不依赖型主要参与胁迫反应等与环境适应性能力显著相关的生物学过程。相关研究结果为多倍体中基因表达的剂量效应提供了新认识。